Na Kemijskem inštitutu v Ljubljani so odkrili princip delovanja pospešene presnove pri tumorjih, kar omogoča hitro rast rakastih celic, in to objavili v ugledni znanstveni reviji PLoS One.
Dejstvo, da imajo rakaste celice spremenjeno presnovo v primerjavi z normalnimi, je že dolgo znano. V 20. letih prejšnjega stoletja je nemški znanstvenik Otto Warburg opazil, da rakaste celice presnovijo bistveno več glukoze kot normalne, vendar pa več kot 80 odstotkov glukoze predelajo v mlečno kislino (laktat), ki jo izločijo. Na celičnem nivoju je pogoj za nastanek t. i. Warburgovega efekta sprememba primarnega metabolizma, bolj natančno glikolizne poti, ki omogoča presnovo glukoze do piruvata.
V normalnih celicah je glikoliza, ki jo katalizira deset različnih encimov, pod stalnim nadzorom, ki določa hitrost celotnega presnovnega toka. Kontrola temelji na zaznavi koncentracije določenih celičnih metabolitov, ki so večinoma končni produkti te poti. Njihova povečana koncentracija ustavi (inhibira) delovanje specifičnih regulatornih encimov glikolize, in šele ko se ti metabolni intermediati porabijo za sintezo v drugih celičnih procesih, ko njihova koncentracija pade, se encimi ponovno aktivirajo.
Ključni regulatorni encim glikolize je 6-fosfofrukto-1-kinaza (PFK), ki ob sodelovanju Mg-ATP fosforilira fruktozo-6-fosfat v fruktozo-1,6-difosfat. Encim je inhibiran ob povečanih koncentracijah citrata in adenozin tri fosfata (ATP) v celici, medtem ko nekatere druge učinkovine, kot so fruktoza-2,6-difosfat in AMP, pospešujejo njegovo delovanje. Med evolucijo so se pri bolj naprednih (evkariontskih) organizmih encimi PFK razvili s podvojitvijo in združitvijo dveh identičnih genov bolj primitivnih (prokariontskih) mikroorganizmov.
Tako je nastal približno dvakrat večji encim, kot je pri bakterijah. Kljub podvojitvi pa se je pri višjih organizmih na encimu ohranil le en aktivni center, medtem ko so se iz preostalega centra z mutacijami razvila vezalna mesta za učinkovine (aktivatorje in inhibitorje), ki nadzorujejo hitrost delovanja encima. Tako omogoča encim PFK pri normalnih sesalskih celicah natančno kontrolo presnove prek glikolize, posledično pa nadzoruje tudi hitrost nastajanja celičnih gradnikov za rast.
Pri rakastih celicah nadzor nad metabolnim pretokom prek glikolize odpove, kar se izraža z Warburgovim efektom, vendar pa prava razlaga za nemoteno metabolno pot do pred kratkim ni bila na voljo.
Sodelavci Laboratorija za biotehnologijo Kemijskega inštituta v Ljubljani so pod mentorskim vodstvom prof. dr. Matica Legiše v ugledni reviji PLoS One pred kratkim objavili članek, ki dokazuje, da v rakastih celicah specifičen proteolitični encim razreže človeški encim PFK na dva dela. Iz izvornega encima 85 kDa nastane manjši fragment 47 kDa, ki ohrani specifično aktivnost, kar pomeni, da obdrži aktivni center, mesta za vezavo pospeševalcev in zaviralcev pa so močno spremenjena.
Natančna analiza aktivnosti na novo nastalih encimov je pokazala, da so kratki fragmenti popolnoma odporni proti motenju delovanja s citratom in ATP, medtem ko pospeševalci dvignejo njihovo aktivnost na višjo raven, kot je na primer pri izhodnem encimu.
Na podlagi meritev encimskih aktivnosti so lahko zaključili, da pretvorba nativnega encima PFK v aktivni kratek fragment ne samo deregulira metabolni pretok (omogoči neobčutljivost na inhibicijo), ampak tudi pospeši delovanje glikolize. Zaradi čezmerne presnove glukoze celice rešujejo nastalo situacijo z izločanjem mlečne kisline, istočasno pa v celicah naraste tudi raven vseh vmesnih metabolitov (intermediatov), ki velikokrat služijo kot začetniki za sintezo celičnih gradnikov, na primer aminokislin.
Da je kratek fragment PFK resnično aktiven tudi v celicah, so dokazali s pripravo skrajšanega gena, ki nosi zapis za humani PFK. Po vnosu modificiranega gena v bakterijo E.coli, ki ni imela lastnih genov za omenjeni encim, se je tvoril aktivni encim, ki je sodeloval pri bakterijskem metabolizmu in ji omogočal rast v gojišču z glukozo. Podoben test so izvedli tudi pri sesalskih celicah, kjer je vnos gena za kratek fragment PFK v netumorigeno celično linijo sprožil hitrejšo porabo glukoze, izločanje mlečne kisline in hitrejšo rast.
Ti rezultati dokazujejo, da se z vnosom gena za kratek fragment PFK lahko pri normalnih sesalskih celicah sproži pojav, podoben Warburgovemu efektu. Videti je, da je kratek fragment PFK glavni motor nekontroliranega metabolnega pretoka prek glikolize, ki ob sodelovanju z nekaterimi drugimi dejavniki v rakastih celicah, kot je okvarjeno sprejemanje dražljajev iz okolja, omogoča hitro rast.
Med študijem značilnosti kratkih fragmentov PFK so opazili, da je encim izredno nestabilen, potem ko se ga osami iz celičnega okolja. To je povezano s strukturo modificiranega encima, ki je drugačna kot pri izvornem encimu. Kljub temu da je hitra izguba aktivnosti oteževala meritve encimskih značilnosti krajših fragmentov, pa je lahko ta lastnost uporabna v primeru, ko bi želeli encim deaktivirati v rakastih celicah. Modificirani encimi PFK, ki so le v tumorskem tkivu, bi namreč lahko postali primerna tarča za delovanje protitumorskih učinkovin, saj bi s preprečevanjem njihove aktivnosti bistveno prizadeli presnovo in ustavili rast rakastih celic.
Proces nastanka visokoaktivnih kratkih fragmentov encimov PFK so na Kemijskem inštitutu kot prvi najprej opisali pri nitasti glivi Aspergillus niger, ki se komercialno uporablja za pridobivanje citronske kisline. Tudi tukaj so z vnosom skrajšanega izhodnega gena za nativni encim, ki je v celicah omogočal nastanek aktivnih fragmentov, dosegli hitrejšo rast gensko spremenjenih celic ter hitrejše izločanje citronske kisline. Glede na to, da sta pravzaprav pri vseh organizmih presnova in metabolna kontrola prek glikolize enaki, so predvidevali, da bi z vnosom modificiranih genov v katerikoli drug organizem lahko pospešili njihov metabilizem.
To je še posebej pomembno pri industrijskih mikroorganizmih, ki bi s takšno gensko spremembo lahko hitreje tvorili določen produkt, prav tako bi bolj učinkovito izkoristili substrat iz gojišča. Na primer, procesa tvorbe mlečne kisline pri humanih rakastih celicah in etanola pri kvasovkah sta zelo podobna. Oba metabolita, ki se izločata iz celic, izvirata iz piruvata, končnega intermediata glikolize, s tem da mlečna kislina nastane neposredno po redukciji piruvata, etanol pa z eno samo dodatno vmesno reakcijo, odcepom CO2 in končno z redukcijo acetaldehida do etanola. Dejansko bi s prenosom modificiranega gena, ki omogoča sintezo visokoaktivnega fragmenta PFK v kvasne celice, pospešili tvorbo etanola, ki kot biogorivo pridobiva pomen kot obnovljiv vir energije.
Zaradi možnosti uporabe gena za modificiran encim PFK v biotehnologiji so na Kemijskem inštitutu že leta 2007 vložili zahtevek za patentno zaščito. Do zdaj so bile patentne pravice podeljene v Sloveniji in ZDA, medtem ko so v EU in Braziliji tik pred podelitvijo.
*
Rak je bolezen, pri kateri se celice nenadzorovano delijo ter imajo sposobnost naselitve v drugih tkivih, bodisi neposredno z vraščanjem v sosednja tkiva ali pa s prenosom in vgradnjo na oddaljenih mestih z metastazami. Tumorska tkiva s svojo prisotnostjo motijo normalno delovanje organov v človeškem telesu, kar v zadnji posledici povzroči smrt. Razvoj rakastega obolenja je pogojen s spremembami na molekulah DNK. Rak je tako predvsem bolezen okvare genov. V normalnih celicah so proto-onkogeni tisti geni, ki pospešujejo celično rast in celično delitev, tumorski supresorski geni pa upočasnjujejo rast in omogočajo popravilo okvarjene DNK. Za pretvorbo normalnih celic v rakaste so potrebne mutacije na obeh tipih genov. Celica, ki se spremeni v rakasto, ponavadi ne pridobi vseh mutacij istočasno, ampak se te nakopičijo v daljšem obdobju. Za maligne rakaste celice je značilnih več specifičnih fizioloških lastnosti, kot so neomejen rastni potencial, odpoved procesa kontrolirane celične smrti (apoptoze), sposobnost razseljevanja in tvorbe metastaz, spodbujanje razvoja prepleta krvnih žil v tumorskem tkivu in nenazadnje pospešena celična rast.
Darjan Andrejc,
mladi raziskovalec
na Kemijskem inštitutu