Pol stoletja intenzivnega proučevanja človeške celice

V treh stoletjih in pol se je, po zaslugi raziskav s svetlobno mikroskopijo angleškega fizika in zdravnika Roberta Hooka, odprl pogled v mikrosvet celic. Elektronska mikroskopija je omogočila raziskovanje nanosveta in razvoj novega področja v naravoslovju – celične biologije; sodobnost je v znamenju korelativne mikroskopije – izrabe prednosti svetlobne in elektronske mikroskopije – in tudi prihodnost bo pripadla njej.

»Elektronska mikroskopija je ena od metod, ki je človeku omogočila preseganje sposobnosti njegovih čutil, da lahko zaznava poprej nezaznavno, in mu odpira pogled v nov kozmos nanostruktur,« nas s pogledom v preteklost in vznemirljivo prihodnost popelje prof. dr. Peter Veranič, predstojnik Inštituta za biologijo celice Medicinske fakultete v Ljubljani in vodja infrastrukturnega centra Biomedicinski center za mikroskopijo UL.

Simbolično povezavo med preteklimi iskanji kaže tudi pet desetletij star elektronski mikroskop v sodobnih prostorih vašega inštituta. Kako se je razvijala celična biologija?

Celica deluje kot nekakšna mikrotovarna za proizvodnjo skoraj vseh organskih molekul, ki jih potrebuje organizem. Za razumevanje delovanja celice je bilo tako treba proučiti njene sestavne dele – organele, kakor jih je že leta 1886 poimenoval nemški zoolog Karl August Möbius. Vendar so zgradbo in delovanje organelov bolj slutili kakor razumeli do iznajdbe elektronskega mikroskopa. Tega je prvi sestavil Ernst August Friedrich Ruska leta 1933. Prvi tržno dosegljiv elektronski mikroskop pa so pod njegovim vodstvom v Siemensu izdelali leta 1939. Za delo na področju elektronske optike je Ernst Ruska leta 1986, dve leti pred smrtjo, dobil Nobelovo nagrado za fiziko.

Z uvedbo elektronske mikroskopije pa sta se kmalu začeli razvijati dve področji, elektronska mikroskopija nebioloških materialov in uporaba elektronske mikroskopije za študij celic. K zgodnji uporabi elektronske mikroskopije pri študiju celic je veliko pripomogel Helmut Ruska, brat Ernsta Ruske. Bil je zdravnik in z uporabo elektronske mikroskopije na bioloških vzorcih se je začel študij celične strukture tako pri normalnih celicah kot raziskovanje celičnih sprememb pri bolezenskih stanjih.

Kaj je drugače pri mikroskopiji nebioloških materialov?

Tu je razvoj usmerjen predvsem v doseganje čim večje ločljivosti slike, kjer so bili v zadnjem času doseženi zelo dobri rezultati: ločljivost je že krepko pod velikostjo najmanjšega atoma, torej atoma vodika. Pri bioloških materialih pa je razvoj bolj usmerjen v postopke priprave vzorcev, pri katerih naj se čim bolje ohranijo celične strukture in hkrati ostanejo gradniki teh struktur še vedno dosegljivi za označevanje, da jih lahko prepoznamo.

Kako bi ocenili razvoj elektronske mikroskopije v Sloveniji?

Za prelomno lahko navedem leto 1965, ko so na pobudo prof. dr. Nade Pipan na takratnem Biološkem inštitutu Medicinske fakultete nabavili presevni elektronski mikroskop znamke Siemens. Zdaj je to, kot rečeno, naš zanimiv razstavni eksponat. S to opremo se je začel tudi razvoj laboratorija, ki je omogočil pripravo vzorcev za opazovanje pod elektronskim mikroskopom. Zato je bil leta 1967 ustanovljen laboratorij za elektronsko mikroskopijo v okviru Biološkega inštituta, ki ga je najprej vodila profesorica Pipanova, pozneje pa prof. dr. Majda Pšeničnik, ki je pri nas uvedla histokemične metode za označevanje organelov. V tem laboratoriju so vpeljali in samostojno razvijali številne metode za pripravo vzorcev za analizo z elektronskim mikroskopom.

Sčasoma je inštitut pridobil novo opremo, tri presevne in dva vrstična elektronska mikroskopa, ki večinoma še vedno delujejo, čeprav so nekateri že zelo stari. Iz te osnovne enote se je elektronska mikroskopija na področju bioznanosti razširila na številne nove institucije v okviru medicinske fakultete, kot sta inštitut za patologijo ter inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, pa tudi na biotehniško fakulteto in druge fakultete in inštitute. V Sloveniji zdaj premoremo nekaj vrhunskih elektronskih mikroskopov, vendar smo zlasti glede kvalitetne priprave vzorcev bioloških materialov opremsko še vedno močno podhranjeni.

Zakaj je priprava vzorcev tako zahtevna?

Razmeroma enostavna priprava vzorcev s tako imenovano kemijsko fiksacijo pogosto kaže popačeno sliko celičnih in subceličnih struktur. Za natančno analizo struktur je nujno vzorce pripraviti po postopku hitrega zamrzovanja. Kakovostna fiksacija z zamrzovanjem pa je zelo zahtevna metoda, ker mora voda v celicah zmrzniti v nekaj tisočinkah sekunde. Le tako dosežemo stanje vitrifikacije, ko voda preide v trdno agregatno stanje, še preden nastanejo kristali ledu, ki bi kakor noži poškodovali strukturo celic.

Takšen postopek zamrzovanja zahteva drage aparature in veliko potrpežljivosti, ker so rezultati pogosto nepredvidljivi. Na našem inštitutu se že desetletja ukvarjamo tudi z metodami za zamrzovanje vzorcev za prikaz membranskih struktur in z označevanjem celičnih struktur, ki predhodno vključujejo metode hitrega zamrzovanja. Te metode je pri nas uvedel prof. dr. Kristijan Jezernik, naprej pa jih razvijajo prof. dr. Rok Romih in mlajši sodelavci.

Ob 50-letnici elektronske mikroskopije med strokovnimi novostmi omenjate tudi korelativno mikroskopijo. Kaj omogoča?

Gre za povezavo svetlobne in elektronske mikroskopije ter izkoriščanje prednosti obeh. Prednost svetlobne mikroskopije je v možnosti študija živih celic, prednost elektronske mikroskopije pa je kljub napredku visokoločljivostne svetlobne mikroskopije nekaj desetkrat boljša ločljivost. S to metodo najprej opazujemo žive celice s svetlobnim mikroskopom, nato pa preparat na hitro zamrznemo in pripravimo za analizo z elektronskim mikroskopom.

Pri tem je seveda ključno, da v fazi opazovanja pod elektronskim mikroskopom najdemo isto mesto, ki smo ga opazovali pod svetlobnim mikroskopom v še živih celicah. Metode za tak prenos iz svetlobne v elektronsko mikroskopijo so še v povojih, tako kot celotna korelativna mikroskopija.

V okviru jutrišnje slovesnosti ob 50. obletnici elektronske mikroskopije na področju bioznanosti v Sloveniji bo korelativno mikroskopijo predstavil vrhunski strokovnjak prof. dr. Roman Polishchuk iz Neaplja, s katerim že nekaj let intenzivno raziskovalno sodelujemo, predvsem prof. dr. Mateja Erdani Kreft, ki to področje pri nas uvaja.

Kaj si lahko predstavljamo pod 'tretjo dimenzijo' v presevni elektronski mikroskopiji?

Del naših raziskav je usmerjen tudi v preseganje problema tretje dimenzije. Namreč, klasične rezine so v elektronski mikroskopiji debele 50 nm, tako je informacija o notranji strukturi celice, ki jo iz take rezine dobimo, praktično dvodimenzionalna. Prostorska predstava o celičnih strukturah je zato zelo težavna in jo rešuje elektronska tomografija, ki pa zahteva uporabo visokonapetostnih presevnih elektronskih mikroskopov z modulom tomografije, kakršnega na področju bioznanosti v Sloveniji še nimamo, zato sodelujemo z medicinsko fakulteto na Dunaju.

V luči klinične medicine vidimo mikroskopijo predvsem kot nepogrešljivo metodo v diagnostiki. Kakšne so še druge možnosti?

Na področju biomedicinskih znanosti bi bila elektronska mikroskopija lahko zelo uspešna tako za diagnostiko kot tudi za spremljanje poteka zdravljenja. Žal se zaradi drage priprave vzorcev za elektronsko mikroskopijo in dolgotrajnega postopka priprave tkiva ta metoda le v redkih primerih bolezni uporablja za rutinsko diagnostiko. Glavnina dela v elektronski mikroskopiji je torej usmerjena v temeljne raziskave, ki pa ne povrnejo vloženih sredstev takoj ali hitro, a so nujne za polnjenje zakladnice znanja, iz katere lahko nato aplikativne raziskave vodijo v razvoj, recimo, novih načinov zdravljenja.

Takšen primer je uporaba elektronske mikroskopije pri razvoju novih tarčnih dostavnih sistemov zdravil, kot so nanodelci za zdravljenje rakavih obolenj, ki jih razvijamo v sodelovanju s sodelavci fakultete za elektrotehniko in inštituta Jožefa Stefana. Le z elektronsko mikroskopijo lahko ugotovimo, ali so takšni nosilci zdravil prispeli na pravo tarčno mesto in s kakšnim celičnim mehanizmom so prispeli do tja.

Podobno smo skupaj s sodelavci fakultete za farmacijo z elektronsko mikroskopijo ugotovili mehanizem delovanja snovi, ki povečajo prehod zdravil skozi epitelijska tkiva. Klasične metode za študij prehajanja snovi skozi tkiva so namreč kazale na povsem drugačen mehanizem delovanja. Sodelovanje s sodelavci s katedre za biokemijo pri oddelku za biologijo biotehniške fakultete je pokazao očitne razlike med membranskimi domenami normalnih in rakavih celic, kar odpira področje iskanja novih tarč za teranostiko, to je sočasno terapijo in diagnostiko, rakavih celic.

Sodobna biomedicina se veliko ukvarja tudi z raziskovanjem rakavih celic. Kakšna je tu vloga elektronske mikroskopije?

To je izjemno vznemirljivo, aktualno področje raziskovanj in dejansko si prav elektronska mikroskopija z novimi označevalci, tako imenovanimi nanodelci, utira pot do razumevanja komunikacije med rakavimi celicami in rakavih celic z normalnim tkivom, in sicer tako pred razsojem celic iz primarnega tumorja kot tudi po ugnezdenju na novo mesto, kjer nastane sekundarni tumor. Kaže, da imajo pri tej komunikaciji pomembno vlogo tako zunajcelični vezikli kot tudi nanocevaste medcelične povezave.

To sta temi, o katerih ima naša skupina nekaj v svetu priznanih pionirskih raziskav. Na modelnih sistemih tridimenzionalnih celičnih kultur in v nekaterih primerih nujno potrebnih živalskih modelov, kar je zastavil prof. dr. Maksimiljan Sterle in jih naprej razvijata prof. dr. Mateja Erdani Kreft in doc. dr. Andreja Erman, se odkrivajo novi mehanizmi te komunikacije, kar daje možnost razvoja novih načinov zdravljenja raka. S tem prehaja elektronska mikroskopija iz bazičnih na področje aplikativnih znanosti tudi v okviru bioznanosti.

Kako bi v Sloveniji lahko bolj gospodarno uporabljali raziskovalno opremo?

Fakultetne raziskovalne skupine, ki potrebujejo drago raziskovalno opremo, imajo veliko težav tako pri nabavi kot pri vzdrževanju opreme. Povprečen elektronski mikroskop stane okrog 300.000 evrov, vrhunski pa presegajo nekaj milijonov … Nakup in vzdrževanje velike opreme sta večinoma prepuščena posameznim raziskovalnim skupinam, ki iz programskih in projektnih sredstev v povprečju dobijo za nakup opreme nekaj deset tisoč evrov na leto. Torej bi za nakup takšne opreme več programskih skupin moralo varčevati celotna sredstva za ta namen deset in več let, kar je med različnimi raziskovalnimi skupinami težko doseči. Nabava opreme je zato pogosto priložnostna, skupina, ki dobi večji projekt, nabavi opremo, ki ji je v tistem trenutku dosegljiva, a je vprašanje, ali je glede kvalitete optimalna in smotrna s stališča širše raziskovalne skupnosti

Kakšno rešitev predlagate?

Na medicinski fakulteti se zavzemamo za ustanovitev centrov, v katerih bi na enem kraju skoncentrirali kakovostno opremo več komplementarnih področij. Takšna ureditev bi omogočala kompleksne raziskave, nujne za reševanje tako temeljnih kot aplikativnih raziskovalnih vprašanj. Takšni centri bi lahko tudi zagotavljali bolj kakovostno podporo zunanjim uporabnikom s pomočjo usposobljenih skrbnikov opreme. Seveda takšna organizacija raziskovalnih centrov, v tujini core facility, zahteva velike finančne vložke in spremembe v organizaciji in miselnosti vseh vpletenih, zato je velik zalogaj za vsakega, ki se tega loti.

Kakšno pa je mednarodno sodelovanje med inštituti?

Znanstvena dejavnost je eno tistih področij, kjer nacionalne meje niso ovira za sodelovanje. Včasih je zaradi večje odprtosti in drugačne organizacije raziskovalne dejavnosti celo lažje sodelovati s tujimi kot z domačimi skupinami. Sodelovanje s centri v tujini je vsekakor nujno za kroženje novega znanja, kar pa seveda pomeni, da moramo tudi sami razvijati vrhunsko znanje in privabljati tuje raziskovalce.

Za to moramo imeti kakovostne raziskovalne centre, kjer bodo ti raziskovalci delovali, in hkrati je treba obetavnim domačim raziskovalcem omogočiti, da prispevajo k razvoju znanosti v Sloveniji, če se je že vlagalo v njihovo izobrazbo. Privabljanje tujih raziskovalcev pa dolgoročno v te centre usmeri tudi tuje finančne tokove, kar povrne investicijo vanje. Seveda je za takšno organizacijo treba dovolj vlagati v slovensko znanost, da se centri lahko razvijejo, in imeti dolgoročno stabilno znanstveno politiko, s čimer se pri nas ne moremo ravno pohvaliti.

Elektronska mikroskopija je ena od metod v širokem področju bioznanosti, ki se zelo dobro dopolnjujejo med seboj. Pričakujem, da se bo tudi v prihodnje razvijala skladno z drugimi metodami za študij strukture in delovanja celic. Pri elektronski mikroskopiji trenutno kaže, da imajo v prihodnjih desetletjih največ možnosti za razvoj zamrzovalne metode priprave vzorcev, za verodostojno ohranitev opazovanih struktur, in korelativna mikroskopija, ki, kot rečeno, združuje svetlobno in elektronsko mikroskopijo, da bi lahko še natančneje proučevali celične procese.